Pētījumi Projekti Visi Projekti
Projekti

Ātrās saites

Gripas vīrusa hemaglutinīna stalka peptīda diagnostiskais un imunoprotektīvais potenciāls: jaunu vakcīnu prototipu izstrāde

 

 

Projekta nosaukums: „Gripas vīrusa hemaglutinīna stalka peptīda diagnostiskais un imunoprotektīvais potenciāls: jaunu vakcīnu prototipu izstrāde”

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 1.1.1.1. pasākuma "Praktiskas ievirzes pētījumi" 1. kārtas ietvaros.

Projekta identifikācijas Nr.: 1.1.1.1/16/A/054

Projekta izpildes termiņš: 2017. gada 1. aprīlis - 2020. gada 31. marts

Projekta kopējais finansējums: 648 643,69 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. A. Kazāks

 

Universālas gripas vakcīnas trūkums ir globāla veselības aizsardzības problēma. Šobrīd īpašu interesi izraisa konservatīvi proteīnu domēni, kas varētu radīt aizsardzību vienlaicīgi pret dažādiem gripas vīrusiem. Viens no strukturāli konservatīvākajiem gripas vīrusa hemaglutinīna (HA) stalka rajoniem ir t.s. LAH (large antigenic helix) fragments. Mūsu līdzšinējie pētījumi ir parādījuši, ka šis 57 aminoskābju garais peptīds E. coli šūnās veido natīvam HA līdzīgu stabilu α-spirāļu trimēru. Pirmkārt, projekts paredz radīt principiāli atšķirīgu vakcīnas prototipu, eksponējot LAH trimēru tā natīvajā formā uz spēcīga imūnas atbildes potencētāja – VLP – virsmas. Tas ļaus saglabāt konformacionālos epitopus, kas nepieciešami vīrusneitralizējošo antivielu atpazīšanai. Tehniski to iespējams realizēt, ģenētiski sapludinot LAH peptīdu kodējošā gēnu ar T=3 simetrijas vīrusa apvalka proteīna gēnu. Līdzšinējie pētījumi vai nu izmantoja atsevišķi dažāda mākslīga HA peptīdu trimērus (veidojas pareizi konformacionālie epitopi, bet konstrukts nav pietiekami imunogēns), vai arī integrēja šos peptīdus VLP sastāvā kā monomērus (veidojas spēcīgi imunogēni, kas nesatur konformacionālos epitopus). Ar augstu varbūtību abu natīvo struktūru (LAH trimers + VLP) kombinācija ļaus konstruēt universālas gripas vakcīnas prototipu. Otrkārt, LAH trimēra attīrīšanas vieglums un efektivitāte padara to par pievilcīgu diagnostisku antigēnu. Tā kā parasti anti-HA stalka antivielas asinīs veidojas ļoti maz, tiks izstrādāta serodiagnostikas metode, lai identificētu cilvēku grupas ar paaugstinātu vīrusneitralizējošo antivielu titru.

Informācija publicēta 03.04.2017.


Projekta progress

2017. gada 1. aprīlis - 2017. gada 30. jūnijs

Projekts tiek realizēts saskaņā ar plānoto laika grafiku. Pirmkārt, ir izveidota virkne oriģinālu DNS konstruktu. Tie kodē gripas vīrusa hemaglutinīna stalka LAH domēnu, kas ģenētiski sapludināts ar dažādu RNS fāgu apvalka proteīnu gēniem, tos atdalot ar kustīgu linkersekvenci. Himēro gēnu ekspresijā E.coli šūnās tika novērots augsts sintēzes līmenis. Lai gan lielākā daļa mērķa proteīnu atradās šūnu nogulsnēs un neizraisa praktisku interesi, tomēr daži ir daļēji šķīstoši. Tie kalpos par pamatu turpmākajai konstruktu optimizācijai.

Otrkārt, tika konstruēts vektors LAH3 gēna ekspresijai. Sākotnēji mērķa proteīna produkcija netika novērota, taču pēc kodonu optimizācijas izdevās iegūt pietiekami augstu sintēzes līmeni. Tika izstrādāta LAH3 attīrīšanas metodika. Tāpat kā LAH1, arī šis proteīns veido trimēru, taču attīrīšanas procesā ir vairākas atšķirības. Tika atstrādāti LAH1 un LAH3 trimēru ilgstošas uzglabāšanas apstākļi pie -20°C. Iegūtie proteīni kalpos par pamatu strukturāliem pētījumiem kā arī imunoloģisku testu izstrādei.

Informācija publicēta 30.06.2017.

 

Projekta progress

2017. gada 1. jūlijs - 2017. gada 30. septembris

Projekts tiek realizēts saskaņā ar plānoto laika grafiku. Šobrīd darbs norisinās paralēli visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.

WP1 noslēgusies aktivitāte 1.1, kur tika izveidota virkne himēru LAH-CP DNS konstruktu. No četriem fāgu strukturālajiem proteīniem tika atlasīti divi perspektīvākie, kuri kalpo par pamatu turpmākajai konstruktu optimizācijai. Aktivitātes 1.2 ietvaros uz fāgu PP7 un AP205 CP bāzes tiek testētas dažādas linkersekvences, kas atdala LAH domēnu no fāgu CP daļas. Izveidotās konstrukcijas tiek salīdzinoši ekspresētas un pētīta to šķīdība kā arī VLP veidotspēja.

WP2 noslēgusies aktivitāte 2.1, kur tika izstrādāta un uzlabota LAH1 un LAH3 trimēru attīrīšanas metodika. Attīrītie trimēri tiks izmantoti imunoloģisku testu izstrādei peļu un cilvēku modeļsistēmās aktivitāšu 2.2 un 2.3 ietvaros. Saskaņā ar plānoto, šīs aktivitātes tiks realizētas ar ārpakalpojuma palīdzību, un šobrīd tiek veikta attiecīgā iepirkuma procedūra.

WP3 aizsākta LAH trimēru kristālstruktūras noteikšana, un jau iegūti pirmie kristāli zema pH apstākļos. Pirmie struktūras dati gaidāmi š.g. beigās.

WP4 aizsākta aktivitāte 4.1. Ar attīrītajiem LAH trimēriem ir imunizētas peles, lai izolētu B-šūnas LAH specifisku antivielu pētījumiem turpmāko aktivitāšu 4.2 un 4.3 ietvaros.

Informācija publicēta 29.09.2017.

 

Projekta progress

2017. gada 1. oktobris - 2017. gada 31. decembris

Projekts tiek realizēts saskaņā ar plānoto laika grafiku. Šobrīd darbs norisinās paralēli visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.

WP1. Aktivitātes 1.2 ietvaros uz fāgu PP7 un AP205 CP bāzes tika testētas dažādas linkersekvences, kas atdala LAH domēnu no fāgu CP daļas. Tika izveidota virkne jaunu konstruktu, kuriem pētīta šķīdība kā arī VLP veidotspēja. Izrādījās, ka linkersekvences izvēle būtiski ietekmē himērā proteīna šķīdību, taču VLP veidošanās pagaidām nav konstatēta. Tādejādi paralēli esošo konstruktu optimizācijai tiek plānota vēl citu nesējproteīnu testēšana LAH trimēru eksponēšanai.

WP2. Attīrītie LAH trimēri šobrīd tiek izmantoti kā antigēni imunoloģisku testu izstrādei peļu un cilvēku modeļsistēmās aktivitāšu 2.2 un 2.3 ietvaros. Saskaņā ar plānoto, šīs aktivitātes tiek realizētas ar ārpakalpojuma palīdzību, ko nodrošina firma iQur Anglijā.

WP3. LAH trimēru kristālstruktūras izpētei tika iegūti proteīnu kristāli dažādos buferšķīdumos skāba pH apstākļos. Sinhrotronā jau ir uzņemti pirmie rentgenstaru difrakcijas spektri, kas kalpos par pamatu turpmākajai struktūras noteikšanai.

WP4. Aktivitātes 4.1 ietvaros ar attīrītajiem LAH trimēriem tika imunizētas peles un no liesas ar FACS palīdzību izolētas atsevišķas LAH specifiskas B-šūnas. No šīm šūnām ar PCR tiks amplificēti, klonēti un sekvenēti gēni, kas atbild par antivielu variablo rajonu sintēzi.

Informācija publicēta 02.01.2018.

 

Projekta progress:

2018. gada 1. janvāris - 2018. gada 31. marts

WP1. Aktivitātes 1.2 ietvaros turpinās mēģinājumi LAH trimēru eksponēšanai uz fāga PP7 VLP virsmas, jo no testētajiem RNS fāgiem tas atzīts par perspektīvāko kandidātu.  Paralēli esošo konstruktu optimizācijai tiek testēti arī citi nesējproteīni, piemēram, ferritīna nanodaļiņas, hepatīta B vīrusa kor-antigēns u.c.

WP2. Attīrītie LAH trimēri tiek izmantoti kā antigēni imunoloģiskiem ELISA testiem, kurus ar ārpakalpojuma palīdzību realizē firma iQur Anglijā. Aktivitātes 2.2 ietvaros ir izstrādāta anti-stalka antivielu detekcijas metode peļu asins serumos. Aktivitātes 2.3 ietvaros šobrīd tiek izstrādāta analoģiska metode cilvēku asins serumos.

WP3. Turpinās datu apstrāde LAH trimēru trīsdimensionālās struktūras iegūšanai. Iegūtie primārie rezultāti liecina, ka trimēri zema pH apstākļos ieņem konformāciju, kas atbilst hemaglutinīna post-fusion formai.

WP4. No izdalītajām LAH specifiskajām B-šūnām ar RT-PCR šobrīd tiek amplificēti un sekvenēti gēni, kas atbild par antivielu variablo rajonu sintēzi.

Informācija publicēta 29.03.2018.

 

Projekta progress:

2018. gada 1. aprīlis – 2018. gada 30. jūnijs

Projekts tiek realizēts saskaņā ar laika grafiku visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.

WP1. Aktivitātē 1.2 turpinās mēģinājumi LAH trimēru inkorporēšanai vīrusveidīgu daļiņu sastāvā. Iegūtie dati liecina, ka šādas himēras daļiņas var iegūt uz hepatīta B vīrusa kor-antigēna bāzes.

WP2. Aktivitātē 2.3 tiek izstrādāta anti-stalka antivielu ELISA detekcijas metode cilvēku asins serumos, ko ārpakalpojuma ietvaros realizē firma iQur Anglijā.

WP3. Turpinās datu apstrāde LAH trimēru trīsdimensionālās struktūras iegūšanai. Iegūtie rezultāti apstiprina, ka trimēri zema pH apstākļos ieņem konformāciju, kas atbilst hemaglutinīna post-fusion formai.

WP4. No LAH specifiskajām B-šūnām ir amplificēti un nosekvenēti vairāki antivielu smago un vieglo ķēžu variablie rajoni, kas kalpos par pamatu turpmākajiem pētījumiem aktivitātes 4.2 ietvaros.

Informācija publicēta 29.06.2018

 

Projekta progress:

2018. gada 1. jūlijs – 2018. gada 30. septembris

 Projekts tiek realizēts saskaņā ar laika grafiku visu četru darba pakešu (WP) ietvaros.

WP1. Noslēgusies aktivitāte 1.2, kur LAH trimēri ir veiksmīgi inkorporēti hepatīta B vīrusa kor-antigēna vīrusveidīgo daļiņu sastāvā. Attiecīgo himēro VLP attīrīšanas optimizācija turpināsies aktivitātē 1.3.

WP2. Aktivitātē 2.3 tiek izstrādāta anti-stalka antivielu ELISA detekcijas metode cilvēku asins serumos, ko ārpakalpojuma ietvaros realizē firma iQur Anglijā.

WP3. Noslēgusies datu apstrāde LAH trimēru trīsdimensionālās struktūras iegūšanai. Iegūtie rezultāti apstiprina, ka trimēri veido konformāciju, kas atbilst hemaglutinīna post-fusion formai zema pH vidē. Izveidotais struktūras fails deponēts PDB datubāzē ar pieejas kodu 6GOL.

WP4. Aktivitātes 4.2 ietvaros no LAH specifiskajām B-šūnām amplificētie antivielu smago un vieglo ķēžu variablie rajoni tiek klonēti ekspresijas vektorā pVITRO-IgG1/κ attiecīgo antivielu sintēzei zīdītāju šūnās.

Informācija publicēta 28.09.2018.




Mājas lapas izstrādi finansēja ERAF 2.1.1.2. aktivitātes projekts Nr. 2010/0196/2DP/2.1.1.2.0/10/APIA/VIAA/004 "Latvijas biomedicīnas pētījumu integrācija Eiropas zinātnes telpā".