Pētījumi Projekti Visi Projekti
Projekti

Ātrās saites

Tehnoloģijas izstrādne augstas kvalitātes vīrusveidīgo uz HBV kor-antigēna balstītu nanostruktūru iegūšanai

Projekta nosaukums: "Tehnoloģijas izstrādne augstas kvalitātes vīrusveidīgo uz HBV kor-antigēna balstītu nanostruktūru iegūšanai."

Projekts tiek veikts Eiropas Reģionālā attīstības fonda (ERAF) 2.1.1.1. aktivitātes „Atbalsts zinātnei un pētniecībai” ietvaros

Projekta identifikācijas Nr.: 2013/0053/2DP/2.1.1.1.0/13/APIA/VIAA/006

Projekta izpildes termiņš: 20 mēneši (2014.gada 1.janvāris - 2015.gada 31.augusts)

Projekta kopējais finansējums: 142 287,18 EUR

Projekta zinātniskais vadītājs: Dr. biol. Andris Dišlers

Projekts veltīts augstas kvalitātes homogēnu vīrusveidīgu nanostruktūru iegūšanai ar daudzfunkcionālu pielietojumu. Projekta specifiskais mērķis ir tehnoloģijas izstrāde modificētu un nemodificētu cilvēka hepatīta B vīrusa kor-antigēna vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai preparātu formā ar augstu tīrības un homogenitātes pakāpi, kas atbilst medicīnisko preparātu kvalitātes prasībām un izmantojamas diagnostikai, vakcīnu dizainā, zāļu, gēnu, imunostimulatoru un imunomodulatoru transportam.

 

01.01.2014.-31.03.2014.

Uzsākot projektu, izvērtēta primāro HBc-producentu ekspresijas vektoru, kas satur klonētus HBc gēnus no HBV F,G, D,A genotipiem, ekspresijas potenciāls un vektoru uzbūves atšķirības. Tāpat izvērtēti primārie šo HBc variantu attīrīšanas rezultāti – HBc produkta VLP iznākums un tīrības pakāpe. Veikta HBc variantu VLP uzbūves modelēšana un izvērtētas dažādiem genotipiem atbilstošo HBc proteīnu ekspresijas optimizācijas iespējas. Uzsākta GFP proteīna iegūšana, izmantojot komerciālu ekspresijas plazmīdu, noskaidrots ekspresijas līmenis, iegūts GFP proteīns analītiskos daudzumos un veikta tā iepakošanās pārbaude, izmantojot D genotipa pilna garuma HBc proteīnu un pielietojot tā veidoto VLP disociāciju līdz subvienībām - dimēriem ar sekojošu dimēru reasociāciju GFP klātbūtnē. Izveidots CFP proteīna producents, uzsākta tā attīrīšana.

01.04.2014.-30.06.2014.

Šajā atskaites periodā tika veikta D genotipa HBc proteīnu iegūšana: 1) HBcdelta (1-145) attīrīšana un disociācija/reasociācija, atstrādājot reakcijas apstākļus un izmantojot producentu IS 721, 2) HBc pilna garuma (1-183) attīrīšana un disociācija/reasociācija, pielietojot agrāk atstrādātu attīrīšanas protokolu un 3) G-genotipa HBc proteīna iegūšana un disociācija/reasociācija, pielietota iegūšanas procedūra, kas izmantota D-genotipa HBc gadījumā, veicot protokolā noteiktas modifikācijas. 2) un 3) gadījumos tika apstrādāti pusprepatīvi šūnu daudzumi, kas ļauj iegūt līdz 15 mg attīrīta gala produkta. Šādi daudzumi ir pietiekami tālākai proteīnu raksturošanai un stabilitātes izpētei. Proteīni tiek uzglabāti dažādos apstākļos tālākai izpētei.  

01.07.2014.-30.09.2014.

Pārskata periodā veikta HBV D genotipa rekombinantā HBc proteīna (pilna garuma HBc, 1-183 amsk, plazmīdas konstrukts pI826) veidoto VLP raksturošana preparātu līmenī: 1) salīdzināti dažāda vecuma HBc) VLP preparāti – svaigs, 8 un 14 mēnešus glabāti preparāti, uzglabājot tos pie dažādas temperatūras (RT, +4 oC, -20oC, -70oC, šķidrajā slāpeklī) un ar vai bez DTT klātbūtnes. Noskaidrota VLP struktūru laba saglabāšanās bez DTT, kā arī ar 5mM DTT,  uzglabājot slāpeklī. VLP struktūras analizētas EM, ar DLS, kā arī imunodifūzijā, elektroforētiskajās analīzēs noteikta monomēru stabilitāte (SDS-PAGE), dimēru līmenis, VLP kustīgums (natīvā forēze). Koncentrācijas noteiktas gan elektroforētiski, gan spektrofotometriski, izmantojot krāsotus un nekrāsotus preparātus. Konstatēta augsta HBc VLP struktūru stabilitāte VLP un subvienību līmenī, kas paver plašas iespējas tālākiem darbiem augstas tīrības klases HBc preparātu iegūšanā.

Sagatavota un iesniegta žurnālam PLoS One publikācija:  “Silica nanoparticles as the adjuvant for the immunisation of mice using hepatitis B core virus-like particles”.

01.10.2014.-31.12.2014.

Projekta ietvaros paredzēta augstas tīrības HBc preparātu iegūšana ar plašu pielietojumu, tajā skaitā funkcionālu substanču iepakošanai HBc veidotajās VLP struktūrās. Paralēli augstas tīrības HBc VLP preparātu ieguvei un atbilstoši projekta mērķiem tiek sagatavoti HBc VLP struktūrās pakojamās substances – proteīni un nukleīnskābes. Kā proteīnu materiāls ir iegūti HBV virsmas proteīna preS1 fragmenti, tos ekspresējot E.coli sistēma tiešas ekspresijas ceļā. Iegūti kā pilna garuma preS1 fragments, tā arī preS1 īsinātais variants, kas nesatur preS1 hidrofobo rajonu. Abu proteīnu tehnoloģiskais iznākums ir atšķirīgs – pilna garuma fragmenta iznākums ir vismaz desmit reizes zemāks. Abi proteīni ir šķīstoši un stabili. Kā nukleīnskābes materiāls tiks izmantots bakteriofāgu MS2 (E.coli) un AP205 (Acinetobacter) genomiskā RNS, šobrīd no baktēriju lizātiem attīrīti abu fāgu preparāti, kas nesatur bakteriālās RNS. MS2 gadījumā iegūti preparāti ar augstu daļiņu iznākumu (~ 10 mg/l), AP205 gadījumā iznākums ir ~ 20 x mazāks. 

 Konstruēta HBV F genotipa HBc ekspresijas sistēma, veikta ekspresijas klonu analīze un atlase, uzsākta preparatīvā HBc proteīna tīrīšana.

01.01.2015.-31.03.2015.

Atbilstoši projekta mērķiem turpināta funkcionālu substanču iepakošana vīrusveidīgās daļiņās - kapsīdās, ko veido hepatīta B vīrusa rekombinantais HBc proteīns – šim nolūkam veikta:

1) pirmkārt, RNS iegūšana un attīrīšana no RNS-bakteriofāgus saturošiem šunu lizātiem, lai pēc tam veiktu RNS iepakošanu HBc kapsīdās, šim nolūkam izmantojot attīrītus wtHBc proteīna (pilna garuma HBc proteīns) dimērus un veicot to reasociāciju kapsīdās RNS klātbūtnē, - panākta E.coli fāga MS2 un Acinetobacter fāga AP205 RNS ieslēgšanās HBc normāla izmēra struktūrās. Abos gadījumos demonstrēta iepakotās RNS funkcionalitātes saglabāšanās, no kapsīdām izdalot iepakoto RNS un ar to veicot E.coli (ar MS2 RNS) vai Acinetobacter (ar AP205 RNS) šūnu transfekciju, šim nolūkam pielietojot elektroporāciju pie augsta sprieguma (2 kV). MS2 RNS gadījumā panākta kā F+, tā F-  E.coli celmu transfekcija, ko apliecina MS2 fāga vairošanās attiecīgo celmu šūnās pēc transfekcijas, fāga titram kultūrā pēc transfekcijas vai nu pieaugot (F+ kultūrā), vai paliekot nemainīgam (F- kultūrā). Pēc līdzīgas shēmas un tiem pašiem mērķiem uzsākta MS2 amber-mutanta f2sus11 un Pseudomonas auriginosa fāga PP7 RNS iegūšana,    

2) demonstrēta HBV preS1 peptīdu ieslēgšanās wtHBc kapsīdās, izmantojot minētos wtHBc dimērus un reasociējot tos kapsīdās vai nu preS1 pilna garuma peptīda, vai modificēta preS1 paptīda klātbūtnē. Peptīdu ieslēgšanās demonstrēta imunoblotos.  

Iegūtie modificētie HBc preparāti izmantojami imunoloģisku pārbaužu veikšanai B- un T-šūnu atbildes noskaidrošanai,

3) veikta HBV genotipu G, E un A korantigēna (HBc) attīrīšana – iegūti augstas tīrības pakāpes vīrusveidīgo daļiņu preparāti.

01.04.2015.-30.06.2015.

 Veikta HBV genotipu B, C un F korantigēna (HBc) VLP iegūšana no attiecīgo producentu šūnām un, līdz ar to, iegūti visi plānotie HBV genotipiem A,B,C,D,E,F,G atbilstoši rekombinantā HBc VVD preparāti. Dažādiem genotipiskajiem variantiem salīdzināta HBc proteīna ekspresija un VVD iznākums - atkarībā no vektora un saimnieka kombinācijas, HBc C-gala Arg kodonu optimizācijas kā arī no producentu kultivēšanas apstākļiem un VVD attīrīšanas shēmas. Pēc vidējā HBc gala produkta (VVD) iznākuma, atšķirīgie genotipiskie varianti grupējas šādi: G-F-D-E-B-C-A. Konstatēts, ka Arg kodonu optimizācija HBc VVD iznākumu būtiski nemaina.

Iepakošanas mērķiem veikta RNS iegūšana no RNS-fāgu P.aurifinosa fāga PP7 un E.coli fāga f2sus11, pārbaudīta RNS infektivitāte, veicot attiecīgo saimniekšūnu transfekciju elektroporācijas apstākļos. Veikta RNS iepakošana D genotipa HBc VVD struktūrās, iepakotās RNS izdalīšana no VVD un retransfekcija.

Atbilstoši projektam, tiek sagatavotas HBV korantigēna iegūšanas tehnoloģijas pdf formātā. Izvērtētas patentēšanas iespējas tehnoloģiskajam paņēmienam HBc VVD iegūšanai, kas satur imunomodulatoras RNS molekulas.             

01.07.2015.-31.08.2015.

Projekta izpildes noslēguma posmā veikta G genotipa HBc daļiņu izpēte, tās pielietojot nukleīnskābju pildīšanai. Pētījumu gaitā tika atrasts, ka disociācijas-reasociācijas ceļā iegūto G genotipa daļiņu uzvedība atšķiras no standarta daļiņu (D genotipa HBc daļiņas) uzvedības un ir ērti pielietojamas dubultspiralizētas RNS iepakošanai. Par tehnoloģiskajām priekšrocībām, ko nodrošina G genotipa HBc daļiņu pielietošana, iesniegts patenta pieteikums Latvijas Patentu valdei. Sagatavots publikācijas manuskripts un iesniegts žurnālam Molecular Biotechnology. Sagatavota tehniskā dokumentācija 35 pdf formāta dokumentu veidā, kas ietver septiņu HBV genotipu HBc vīrusveidīgo daļiņu preparātu ieguvi, daļiņu raksturojumu un vairāku veidu daļiņu (D un F genotipa) pielietojumu substanču pakošanai pēc daļiņu disociācijas līdz dimēriem.




Mājas lapas izstrādi finansēja ERAF 2.1.1.2. aktivitātes projekts Nr. 2010/0196/2DP/2.1.1.2.0/10/APIA/VIAA/004 "Latvijas biomedicīnas pētījumu integrācija Eiropas zinātnes telpā".